EXTRACCIÓN DE ADN
En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones
y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda
mediante marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función
conocida que proporcionan información, La aplicación de técnicas moleculares inicia
con la extracción de ADN y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles
depende, en gran medida, de la extracción de ADN íntegro y puro.
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN
y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido
por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión
de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces
fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas
opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura
helicoidal.
Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le
confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características
que son aprovechadas para su extracción. Los grupos fosfato tienen una
fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver
al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la
molécula.
La extracción de ADN íntegro y sin contaminantes es esencial para tener
éxito en la obtención de datos genéticos, es el primer paso en la lista de técnicas
moleculares que nos llevarán a comprender mejor y conservar la diversidad
biológica a partir del conocimiento de genes y genomas que anteriormente era
inaccesible para le ecología y la evolución.
La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas
moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible
y su estado de conservación, la técnica que se aplicará posteriormente, así
como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo
para obtener resultados. Independientemente del método seleccionado es recomendable
encontrar un equilibrio entre pureza y rendimiento de acuerdo a
la aplicación posterior.
La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una
extracción del ADN exitosa. Una colecta y manejo apropiado de la muestra permite obtener ADN integro y
sin contaminantes, los cuales afectan la acción de las enzimas durante la reacción
de PCR. Cada tejido tiene sus consideraciones propias y siempre será necesario conocerlas
o preguntar a los especialistas de cada grupo para llevar a cabo una colecta
y extracción exitosas.
En este caso en una muestra de Sangre utilizar agujas de calibre apropiado,
respetar la relación muestra/
anticoagulante y homogeneizar
correctamente la muestra para
evitar la hemólisis y/o coagulación,
y la contaminación
bacteriana. Una vez obtenida la
muestra es importante evitar
movimientos bruscos durante el
transporte.
Las muestras pueden mantenerse
por unos días a 4 ºC después
de su colecta. Si se congela la
muestra a -20 °C, debe descongelarse
a temperatura ambiente
y procesarse en su totalidad pues
una vez descongelada, inicia la
hemólisis, por ello es aconsejable
hacer alícuotas.
ETAPAS DE LA EXTRACCIÓN DE ADN:
Separación de proteínas y lípidos:
En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes
orgánicos y ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia
hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras
que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos (Sambrook et
al. 1989). La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que
permite aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol,
el cloroformo y el alcohol isoamílico (Stulnig y Amberger 1994). Estos reactivos
contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el
proceso de purificación.
Precipitación del ADN:
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de
sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas
repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo
haciéndolo insoluble. Un paso de centrifugación permite que el
ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el etanol es desechado. Los
restos de etanol se eliminan con un lavado con etanol al 70% y el remanente se
elimina por evaporación.
Redisolución del ADN:
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe
ser de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis
ácida . Cuando se utiliza una solución amortiguadora,
es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a
un pH de 8.0 para almacenar el material. Cuando se está disolviendo
el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitación agresiva pues se pueden
fragmentar moléculas de alto peso molecular. Una opción que evita la frag-
12 Herramientas moleculares aplicadas en ecología
mentación consiste en incubar a 55 °C el ADN, 1 a 2 horas con agitación suave.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA EXTRACCIÓN DE ADN
VENTAJAS
- Curación de enfermedades genéticas.
- Prevención de enfermedades crónico degenerativas en recién nacidos.
- Prevención de enfermedades psiquiátricas( desde depresión hasta esquizofrenia).
- Uso estético que va desde evitar la calvicie masculina y femenina, hasta escoger el sexo, color de cabello, ojos, etc de tu bebe.
- Prevención de algunos tipos de canceres.
- Aceptación de órganos.
- La posibilidad de evitar la extinción de especies.
- Mejora de alimentos.
DESVENTAJAS
- Riesgos desconocidos.
- Probabilidad de discriminación por parte de inescrupulosos.
-
Probable beneficio solo para algunos por el factor económico.
Por ultimo la extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula.